Coloração de Gram

                           Coloração de Gram

Introdução

Em 1884, dinamarquês Hans Cristian Gram observou que ao tratar bactérias com diferentes corantes, elas adquiriam cores distintas. Isso permitiu classificá-las em dois grupos: as que se coravam de roxas, então denominadas de Gram-positivas, e as que se coravam de rosa ou vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Essa classificação se refere às diferenças da composição da parede celular. As bactérias Gram-negativas possuem uma fina camada de peptideoglicano e uma membrana externa composta por bicamada lipídica, a qual se solubiliza na presença do álcool-acetona (agente diferenciador), perdendo a coloração do cristal violeta (corante primário), adquirindo a coloração rosa ou vermelho do corante secundário, safranina ou fucsina.

Já as bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e grandes quantidades de ácido teicóico, adquirem a coloração violeta ou roxa pela capacidade em reter o corante primário na presença do agente diferenciador, conforme descrito na figura 1.

Na técnica de Gram, um esfregaço é fixado na lâmina pelo calor e coberto com um corante primário, geralmente o cristal violeta. Após um minuto, o esfregaço é lavado e em seguida cobre-se a lâmina com lugol, que age como mordente (fixador), fixando o cristal violeta. Nessa etapa tanto as bactérias Gram-negativas como as Gram-positivas permanecem com a coloração violeta. Em seguida, a lâmina é lavada com uma solução de álcool-acetona a 95%. Esta solução age como descolorante, retira o cristal violeta das bactérias Gram-negativas e deixando-as incolores. Após essa etapa o excesso do álcool é retirado e em seguida as bactérias são submetidas ao corante secundário, podendo ser a fucsina ou safranina a 0,1 a 0,2%. A lâmina é lavada, seca com papel-filtro e observada ao microscópio óptico, aplicar uma gota de óleo de imersão e observar na objetiva de imersão (100X).

Objetivos

• Compreender e aprender sobre a técnica de Gram;
• Visualizar as diferentes morfologias entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

Materiais

• Alça de platina (bacteriológica);
• Álcool-acetona (descorante);
• Bico de Bunsen;
• Cristal-violeta (corante);
• Cultura de bactérias Gram-positivas e/ou cultura de bactérias Gram-negativas;
• Fucsina ou Safranina (corante);
• Lâminas para microscopia;
• Lamínulas;
• Lugol a 1% (mordente);
• Microscópio óptico;
• Óleo de imersão;
• Papel absorvente.

Metodologia

• Confecção do esfregaço (colocar uma gota de salina sobre a lâmina, tocar com alça bacteriológica a colônia isolada e espalhar na salina com movimentos ovais. Fixar com calor, passando a lâmina sobre chama de bico de Bunsen de 2 a 3 vezes até completa secagem do esfregaço);
• Cobrir com cristal violeta por 1 minuto.
• Lavar com água corrente;
• Cobrir com Lugol 1% por 1 minuto;
• Lavar com água corrente;
• Aplicar o agente diferenciador álcool-acetona 95% por 10 a 20 segundos;
• Lavar com água corrente;
• Cobrir com Fucsina ou Safranina (0,1 a 0,2%) por 30 segundos;
• Lavar com água corrente e secar com papel-filtro;
• Observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão (100X).

 O que é a coloração de Gram?

  Como funciona a coloração de Gram?

 Qual é a importância da coloração de Gram?

       Quais são as principais diferenças entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas?

Quais são alguns exemplos de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas?

Referências 

FLEMING, D. O. et al. Laboratory Safety: Principles and Practices, 2ºed. American Dociety for Microbiology. Washington, DC.

 

Gashaw M, Berhane M, Bekele S, Kibru G, Teshager L, Yilma Y, Ahmed Y, Fentahun N, Assefa H, Wieser A, Gudina EK, Ali S. Emergence of high drug resistant bacterial isolates from patients with health care associated infections at Jimma University medical center: a cross sectional study. Antimicrob Resist Infect Control. 2018

 

O'Toole GA. Classic Spotlight: Como funciona a coloração de Gram. J Bacteriol. 2016 Dez 01; 198 (23):3128. [ Artigo gratuito PMC ] [ PubMed ]

Rand KH, Tillan M. Erros na interpretação de colorações de Gram de hemoculturas positivas. Am J Clin Pathol. 2006 Nov; 126 (5):686-90. [ PubMed ]

 

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